2013年，張鋒等科學(xué)家首次將CRISPR-Cas9技術(shù)應(yīng)用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞，是基因編輯領(lǐng)域中里程碑式的進(jìn)展。時(shí)隔十年，2023年6月28日，美國(guó)Broad研究所/麻省理工學(xué)院張鋒團(tuán)隊(duì)（Makoto Saito和徐沛雨為論文共同第一作者）在Nature雜志發(fā)表研究論文，在真核生物中發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)RNA引導(dǎo)的DNA切割酶-Fanzor，與CRISPR-Cas系統(tǒng)相比，其廣泛存在于真核生物中，沒(méi)有旁系切割活性，不僅更容易遞送到細(xì)胞和組織中，而且能夠?qū)崿F(xiàn)更精準(zhǔn)的基因編輯，一定程度上彌補(bǔ)了CRISPR-Cas的不足之處。

　　2024年，張鋒院士團(tuán)隊(duì)在基因編輯領(lǐng)域的重磅研究令人矚目。5月29日，張鋒院士團(tuán)隊(duì)與其合作者在Nature雜志發(fā)表研究論文Structural basis for pegRNA-guided reverse transcription by a prime editor，展示了SpCas9-M-MLV RTΔRNaseH-pegRNA-target DNA復(fù)合物在不同構(gòu)象狀態(tài)下的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)。

　　8月6日，張鋒團(tuán)隊(duì)在Molecular Cell發(fā)表研究論文Structural determinants of DNA cleavage by a CRISPR HNH-Cascade system，描述了Selenomonas sp. HNH-Cascade (SsCascade)與靶DNA復(fù)合物的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，表征了其作用機(jī)制。

　　2024年8月28日，張鋒團(tuán)隊(duì)（徐沛雨和Makoto Saito為論文共同第一作者）再接再厲，在Cell雜志發(fā)表研究論文Structural Insights into the persity and DNA Cleavage Mechanism of Fanzor，該研究首次展示了Fanzor(Fz)蛋白在不同生物中所表現(xiàn)出的分子多樣性，深入解析了其通過(guò)RNA引導(dǎo)的DNA切割機(jī)制。且首次揭示了Fz1蛋白的激活和裂解機(jī)制，闡明了促進(jìn)其作為RNA引導(dǎo)的內(nèi)切酶功能的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，為基因工程改造和開(kāi)發(fā)奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。

　　1. 三種物種中不同構(gòu)象狀態(tài)下的Fanzor冷凍電鏡結(jié)構(gòu)

　　Fanzor蛋白主要存在于原口菌、藻類、真菌和單細(xì)胞真核生物中，由Fz1和Fz2兩個(gè)蛋白家族組成。那么在不同物種中，F(xiàn)z1蛋白會(huì)有什么特點(diǎn)呢？研究團(tuán)隊(duì)克服巨大的技術(shù)障礙，首先通過(guò)冷凍電鏡解析了來(lái)自不同物種的Fz1蛋白以及不同構(gòu)象下的13個(gè)結(jié)構(gòu)，包括來(lái)自藻類Guillardia theta的GtFz1、真菌Spizellomyces punctatus的SpuFz1和寄生真菌Parasitella parasitica的PpFz1。

　　例如，研究團(tuán)隊(duì)獲得了6個(gè)不同DNA結(jié)合狀態(tài)下的SpuFz1復(fù)雜結(jié)構(gòu)，分辨率從2.9?到3.4?不等。以4種不同構(gòu)象下的PpFz1-uRNA-DNA復(fù)合物結(jié)構(gòu)為例，其分辨率從3.2?到 3.5 ?不等。從結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)可以發(fā)現(xiàn)，在三個(gè)物種的所有Fz1s結(jié)構(gòu)中，蛋白質(zhì)與RNA相互作用的界面是相似的，這表明在不同的Fz1s之間存在一種保守的RNA引導(dǎo)的DNA靶向機(jī)制。

　　2.Fanzor的共同特征和結(jié)構(gòu)多樣性

　　Fz1蛋白的共同特征和結(jié)構(gòu)多樣性是什么呢，其保守的DNA靶向機(jī)制具體是什么？研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)Fz1主體蛋白大多由600-700個(gè)氨基酸組成，具有相對(duì)保守的結(jié)構(gòu)域。這三種Fz1蛋白的整體結(jié)構(gòu)顯示出顯著的相似性，它們都具有雙葉結(jié)構(gòu)特征，并以類似的方式容納wRNA和目標(biāo)DNA，與TnpB結(jié)構(gòu)一致。

　　在支架區(qū)域里，GtFz1 wRNA結(jié)構(gòu)包含三個(gè)莖環(huán)，SL2的遠(yuǎn)端和環(huán)區(qū)域與SL4形成廣泛的相互作用，折疊在一起，發(fā)現(xiàn)保守的氨基酸R85對(duì)DNA結(jié)合至關(guān)重要。此外，GtFz1中的氨基酸F392、SpuFz1中的氨基酸Y345以及PpFz1中的氨基酸R448與DNA靶向臨近基序（Target-adjacent Motif, TAM）中TS的最后一個(gè)堿基形成堆疊的相互作用。

　　3. 局部構(gòu)象變化調(diào)控Fanzor對(duì)目標(biāo)DNA的操作

　　那么，GtFz1、SpuFz1和PpFz1三個(gè)蛋白對(duì)于目標(biāo)DNA的操作有什么區(qū)別嗎？研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)GtFz1的催化三聯(lián)體中出現(xiàn)了非典型的N殘基，能夠增強(qiáng)了其體DNA切割活性。PpFz1 中的一個(gè)獨(dú)特結(jié)構(gòu)域能夠與一種被稱為親環(huán)蛋白（Cyclophilin）的蛋白質(zhì)結(jié)合，提示其可能在寄主生物的生理功能中具有重要的作用。

　　值得一提的是，在GtFz1中，未結(jié)合DNA的狀態(tài)以及兩個(gè)結(jié)合了不同形式DNA的結(jié)構(gòu)展示了REC結(jié)構(gòu)域在R-loop形成和穩(wěn)定中的關(guān)鍵構(gòu)象變化。在SpuFz1和PpFz1中，研究解析了具有不同數(shù)量Guide/DNA堿基配對(duì)的結(jié)構(gòu)，揭示了RuvC結(jié)構(gòu)域中的一個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)。三種結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)上的區(qū)別揭示了Fanzor如何調(diào)控自身以激活DNA切割活性。

　　研究總結(jié)與展望

　　總之，本研究再次加深了對(duì)基因編輯系統(tǒng)的探索，張鋒院士團(tuán)隊(duì)通過(guò)來(lái)自不同物種以及不同DNA結(jié)合構(gòu)象的Fanzor蛋白結(jié)構(gòu)分析，揭示了該家族蛋白的分子多樣性，并揭示了Fanzor蛋白的激活機(jī)制，為未來(lái)基因編輯工具的設(shè)計(jì)增添了濃墨重彩的一筆！